琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）类杀菌剂在防治谷物病害方面具有重要的作用，可有效防治小麦叶枯病、小麦叶锈病或大麦云纹病等大多数谷物重要病害。

       Isoflucypram（开发代号BCS-CN88460，商品名iblon）是拜耳作物科学公司开发的新型琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）类杀菌剂，其持效期长，可延长谷物灌浆时间。Isoflucypram于2019在新西兰首获登记，用于防治大麦网斑病、叶斑病、叶锈病，小麦条锈病、叶锈病、叶枯病，黑麦条锈病和叶锈病等，可提高谷物产量和品质。

1  理化性质

       Isoflucypram的IUPAC化学名称：N-(5-氯-2-异丙基苄基)-N-环丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺；CAS化学名称：N-[[5-氯-2-(1-甲基乙基)苯基]甲基]-N-环丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺。CAS登录号：1255734-28-1。

图1  Isoflucypram结构式

       在20℃和101.3 kPa，纯品为无味白色粉末，原药为具有轻微气味的浅米色粉末。熔点108.8℃，在215℃开始分解；相对密度：纯品D⁴₂₀=1.22，原药D⁴₂₀=1.31；蒸气压：1.2×10^-7 Pa（20℃）、2.8×10^-7 Pa（25℃）、1.5×10^-5 Pa（50℃）；表面张力σ=68.2 mN/m（90%饱和溶液，20℃）。水中溶解度：1.8 mg/L（20℃，蒸馏水，pH 5.8）；有机溶剂中的溶解度（20℃，g/L）：正庚烷1.2，甲苯＞＞260，二氯甲烷＞260，甲醇97，丙酮＞260，乙酸乙酯＞260，二甲亚砜＞260。分配系数：logPow=4.0（25℃）。 

2  毒性

       原药（94.2%）对大鼠急性经口LD₅₀＞2,000 mg/kg，对大鼠急性经皮LD50＞2,000 mg/kg,对雄性大鼠急性吸入LC50为3.131 mg/L，对雌性大鼠急性吸入LC50为2.209 mg/L。对兔皮肤无刺激性，对兔眼睛没有刺激作用，会引起小鼠皮肤过敏反应。对哺乳动物没有基因毒性、致癌性，对发育、繁殖没有影响，没有神经毒性。对黑头呆鱼（Pimephales Promelas）的LC50（96 h）为0.0861 mg/L，虹鳟LC50（96 h）为0.104 mg/L，对大型溞EC50（48 h）0.201 mg/L，羊角月牙藻EC50（72 h）＞2.02 mg/L，浮萍EC50（7d）＞2.48 mg/L。Isoflucypram对水生生物毒性高，而且作用时间长。

       对蜜蜂的毒性：触杀毒性LD50（48 h）＞100.0 μg a.i./只，经口毒性LD50（48 h）＞106.3 μg a.i./只；对山齿鹑急性经口LD50＞2,000 mg a.i./kg bw，对绿头鸭的急性经皮LD50＞1,360 mg a.i./kg bw；对安德爱胜蚓LC50＞1,000 mg a.i./kg bw（土壤）。

       由上述内容可知，isoflucypram对哺乳动物具有较低的急性毒性，对水生生物毒性很高，对陆生生物没有毒性。

       Isoflucypram在水生环境和土壤环境中持效期长，在土壤中的迁移能力低，生物积累性弱。

3  创制过程

       Isoflucypram的发现可追溯到通用结构为A的磺酰甲酰胺（图2），此类物质是经化学库设计合成，是早期先导物，其活性谱窄，对白粉病、褐锈病、网斑病等真菌病害有效。为了发现新的除草剂或杀虫剂，Desbordes Philippe等人把Rohn & Haas发现的除草活性结构A1和杀虫剂氟啶虫酰胺（A2）拼接，同时对A1中的炔丙胺基或A3中的氰甲胺基进行优化，如替换为烯丙胺、异丙胺和环丙胺等小的胺基团。取代为环丙胺后发现了氟喹啉类抗生素环丙沙星（A4）。把A3结构中的4-(三氟甲基)吡啶-3-甲酰胺部分衍生为五元杂环，特别是吡唑杂环，众所周知吡唑是是氟唑菌苯胺（A5）等杀菌剂的核心部分。

图2  杀菌剂磺酰甲酰胺化学结构的发现

       A6是被发现的第一个具有温室盆栽杀菌生物活性的磺酰甲酰胺化合物，其作用机制未知。以A6为先导，对芳基磺酸、氨基和吡唑酸进行衍生优化（图3）。结果发现3-取代吡唑甲酸（A7a-c），特别是5-氟吡唑-4-基甲酸（A7a）对杀菌活性重要，其直接作用于SDH。环丙胺基是维持活性的必要因素，而其他氨基取代物活性降低或活性消失。对亲脂性磺酸部分的修饰发现邻位氯代苯基（A8）和对位苯氧取代的苯基（A9）化合物活性增加。

图3  具有杀菌活性的磺酰甲酰胺：从苗头（hit）化合物到先导物的修饰过程

       把含氯亲脂磺酸基（A8）和3-取代吡唑甲酸基（A7a-c）合并得到了在温室生测中杀菌活性提高的化合物A10和A11（图4）。对A11进行了田间谷物病害生物活性测定，试验结果为即使高的使用剂量，化合物的活性也弱。

图4  具有杀菌活性的磺酰甲酰胺：先导物结构

       A10对黑粉菌属SDH的离体活性中等，但对葡萄孢属、Zymoseptoria和伞菌属（Agaricus）菌的SDH有强的抑制作用。强的离体活性表明环丙基取代物不是药物前体，此取代基是A10与受体结合的必要组成部分。然而，发现A10和A11在植物体内很快降解，活性降低。在此发现的基础上，对磺酰甲酰胺进行更多的修饰研究。

       为了解决化合物A11在田间活性差的问题，对磺酰胺基团进行了进一步的修饰。羰基或硫原子取代磺酰基团产生的化合物无活性，而烷基取代对离体和温室生测杀菌活性有大的影响。把氟吡菌胺A12的亲脂侧链结合到化合物A11的N-环丙基酰胺基团上得到了新化学类别化合物A13，此化合物对数种真菌病原菌的SDH有很强的抑制活性（图5）。很快研究发现化合物A13的吡啶环能被苯环取代，且必须要很好地控

       制苄基基团和N-环丙基间的二面角。这可通过邻位取代大的基团和/或苄基来实现。而在邻位的再取代会增加此效应，由此取代产生化合物A14和A15。

图5  具有杀菌活性的N-苄基-N-环丙基甲酰胺和其首次优化

       对酸部分进行了充分的研究，以200多个5元或6元环取代最初的5-氟-1,3-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸（A7a，R=CH₃）。发现已知SDHI抑制剂具有的典型吡唑结构为A7a（R=CH₃）和A7b，使化合物具有广谱活性。此外，注意到吡唑环的-5-氟取代有重要作用，故评估了含有由效果最好两个酸——A7a（R=CH₃）和A7b结合所得的酸A7a（R=CHF₂）的化合物的活性（图6）。此酸部分使化合物对SDH的抑制活性提高了1～2个数量级，活体试验的ED₅₀降低了。

图6  酸部分的构效关系

       对于磺酰甲酰胺，2-甲基环丙基取代基除了是活性部分外，环丙基几乎是酰胺氮仅能接纳的取代基。这再次证实N-环丙基衍生物不是药物前体，因为发现几乎所有NH类似物无活性。相反，发现硫代酰胺是酰胺的真正药物前体，硫代酰胺在植物体内具有相似水平的活性，但直接作用于靶标没有活性。

       化合物A15（图7）的2-三氟甲基可被卤元素（如溴、碘），小烷基（例如异丙基、异丁基）或环烷基（例如环丙基），甚至是较大基团取代，例如三烷基硅烷（三甲基硅烷[TMS]、三乙基硅烷），得到对子囊菌和担子菌有高活性的化合物。邻苯取代物的构效关系（SAR）为2-iPr＞2-CF₃≥2-I＞2-TMS。A16的2-异丙基取代衍生物对Zymoseptoria tritici细胞的ED₅₀最小（表1），且对细胞的活性和温室、大田试验活性相差无几。

图7  对具有杀菌活性的N-苄基-N-环丙基甲酰胺的进一步优化得到isoflucypram（1）

表1  A16衍生物对Zymoseptoria tritici

       注：n.t，没测试；ED₅₀为8次重复的平均值；括号中为标准偏差；isoflucypram的ED₅₀为（0.05±0.008）mg/L，为参考。

       对苯基、酰胺和吡唑基团的最优取代组合在一起得到化合物A17。在这些高活性的衍生物中，选取了isoflucypram（1），此物质具有较好的活性和安全性（图7）。

4  N-环丙基-N-苄基甲酰胺的亲和力数据和可能的结合方式

       琥珀酸辅酶Q还原酶（又称SDH）是线粒体内膜上的异四聚体酶复合体。SDHI杀菌剂作用于病原菌线粒体内膜上由亚基B、C、D组成的辅酶Q。

       再观FRAC C2-SDHI类化合物，大多数SDHI通过其甲酰胺部分与病原菌发生一定的作用。据推测，甲酰胺氢与病原菌的辅酶Q结合位点的Ser83C形成水介导的氢键。图8为联苯吡菌胺与辅酶Q结合位点的结合方式。

图8  推测联苯吡菌胺与Zymoseptoria tritici辅酶Q结合位点的二维结合方式

       假定环丙基N-苄基甲酰胺的结合方式与典型的SDHI的相似，如图9所示。甲酰胺氧原子与保守的色氨酸NH侧链形成氢键，吡唑基团与组氨酸NH侧链形成另一氢键。氯取代苯环可能结合到真菌和线虫特有的疏水口袋中。

图9  推测isoflucypram与Zymoseptoria tritici辅酶Q结合位点的二维结合方式

       然而，与典型的SDHI相比，N-环丙基不支持水介导的氢结合到Ser83C。在通用结构2的基础上合成了含有不同N-取代基（X）的数个化合物，并测定了这些物质对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的复合体酶的抑制活性（表2）。

表2  通用结构2衍生物对灰葡萄孢菌复合体Ⅱ酶的pl50

       注：a为3次重复平均值；括号中为标准偏差；isoflucypram的pl50为（8.6±0.0），为参考。

       如果N-环丙基-N-苄基甲酰胺各方面的表现都和常见的SDHI一样，预期NH衍生物2b活性要高于N-环丙基衍生物2a。但是，虽然2a不能形成上述所提及的水介导的氢键，它也具有很大的pl50，显著高于2b的抑制活性。化合物的活性因N-取代基不同而不同。当环从N-环丙基（2a）变为N-环丁基（2i），即环的大小增加时，pl50降低一个数量级；变为N-环戊基（2j），pl50降低3个数量级。把环丙基环打开为N-异丙基（2g），所得化合物几乎没有离体活性。总的来说，N-甲酰胺取代的构效关系非常清晰，N-环丙基化合物的活性最好。

       pl50增加可能是由于在结合口袋中失去1个水分子所致。熵增益远远弥补了水介导氢与Ser83C结合的缺乏，如化合物1具有极大的pl50所表明的。

       除环丙基基团外，N-环丙基-N-苄基甲酰胺具有前所未有的次级结构模式——苯基和甲酰胺基团间的C1链。

       所有已知的SDHI要么不含有连接链（如啶酰菌胺、联苯吡菌胺或氟唑菌酰胺的吡唑-4-甲酰胺），要么不含有C2链（氟吡菌酰胺和氟唑菌酰羟胺）。对化合物3（C1链）和化合物4（无连接链）的pl50比较后优先选择具有C1链的化合物3（图10）。

       注：对Neurospora crassa的SDH测定的pl50。

图10  对N-环丙基化合物3（C1链）、4（无连接链）和参照物isoflucypram（1）的比较

       与N-环丙基的清晰的离体构效关系相比，结构5的化合物链的延伸（A）没有明显的构效关系（表3）。

       所有（未）取代的C1和C2链与N-环丙基组合的化合物都具有高的离体活性。含有未取代C1链的化合物具有较高的温室和田间活性以及广谱杀菌活性。

       对SDH抑制剂以前所未有的方式进行取代得到了C2-琥珀酸脱氢酶抑制剂类别的一个新子类杀菌剂isoflucypram，也称为N-环丙基-N-苄基甲酰胺。与其他SDHI相比，isoflucypram结合方式的改变是否使其与其他SDHI不具有交互抗性，这还需要进行进一步的研究。

表3  基于通用结构5的化合物对Botrytis cinerea复合体酶Ⅱ的pl50

       注：a为3次重复平均值；括号中为标准偏差；isoflucypram的p150为（8.6±0.0），为参考。

5  总结

       Isoflucypram广谱，对哺乳动物低毒，可能是谷物杀菌剂市场新的标杆——能很好地、持效地防治所有相关的叶部病害，增加作物产量。Isoflucypram是在丰富的SDHI化学知识的基础上对不同结构基团进行结合，化学优化得到的物质。Isoflucypram的生化构效关系表明其与SDH辅酶Q结合。2个独特的结构基团——N-环丙基、甲酰胺和苯基间的C1链使isoflucypram成为FRAC复合体Ⅱ抑制剂类的子类。