减少化学农药使用，开发对人类和环境更有益的作物保护产品是全世界的共识。微生物是广泛存在于生物体内和各种环境因子中的最庞大的生物类群，它们与其他各类生物包括人类的生存以及环境的可持续性都有密切关系。人类对微生物与植物间相互关系的研究，以及利用基于微生物的肥料或农药为作物生产保驾护航由来已久。近年来，人们对微生物-作物相互关系的研究和利用更加深入和全面，从种子处理、土壤改良到对生长期间的作物的保护等方面都有微生物的参与。而且这个方向被认为是未来保护作物健康生长，为人类提供丰富食品的重要措施之一。尤其是近几年，植物生物刺激剂产业的进一步发展也促进了有益微生物的开发利用。

       根据2019年颁布的欧盟肥料新法规，植物生物刺激剂主要有微生物类和非微生物类两大类别。本文将对微生物类植物生物刺激剂（以下简称微生物类生物刺激剂）的发展做一简单介绍。

1  对植物有益的微生物

       许多微生物包括真菌、放线菌、细菌[包括植物根际促生细菌（PGPR）]都具有促进植物生长的功效。这些微生物可以作为生物防治剂或生物刺激剂，保护植物，帮助物料循环利用，增加养分吸收，改善植物健康等。

       根际细菌与植物的相互作用是植物健康和土壤肥力的决定因素。独立生存的土壤细菌有利于植物的生长，通常简称植物根际促生细菌（PGPR），能够通过在植物根部的定植促进植物生长。PGPR也被称为促进植物健康的根际细菌（PHPR）或促根结菌（NPR）。PGPR是迄今为止研究最多的有益于植物的微生物。

       PGPR对植物生长有直接和间接两个方面的促进作用（表1）。

表1  植物根际促生细菌对植物的作用

       PGPR对植物的有益作用可以概括为以下几个方面：

       （1）帮助植物获取养分

       帮助植物获取养分的微生物通过多种机制发挥作用，包括扩大植物根系获取营养的表面积、固氮、溶解磷、产生铁载体和HCN等。因此，可以通过调控PGPR的生物活性为作物提供营养。

       （2）PGPR在作物根系与植物之间进行信号传递

       ① PGPR产生激素

       植物激素是调节植物生长发育的重要物质。它们还作为分子信号对环境因素做出响应，否则植物生长就会受到不利环境的限制甚至死亡。许多根际细菌能分泌植物激素对植物的根系吸收或激素平衡进行调节，以促进植物的生长和提高应激反应能力。

       如很多种PGPR可以产生生长素，对植物根系生长、发育和形成有很大影响。吲哚-3-乙酸是研究最广泛的由PGPR产生的激素，它与植物-微生物间的相互作用有关。

       ② 微生物次生代谢产物作为微生物对植物的信号分子

       细菌产生的大量次生代谢产物和挥发性有机化合物（VOCs）可以提高植物的抗逆性和/或促进植物的生长。例如，多胺在植物中发挥着重要的生理和保护作用。巨大芽孢杆菌BOFC15分泌一种多胺——亚精胺，能诱导拟南芥产生多胺，导致生物量的增加，并改变根系结构和提高光合能力。被接种这种菌株的植株在聚乙二醇（PEG）诱导的水分亏缺胁迫下表现出更高的耐旱性和脱落酸（ABA）含量。有多种PGPR可产生氢氰酸（HCN），从而控制根际有害微生物的水平。PGPR产生的挥发性有机化合物刺激植物生长，从而增加地上部生物量，提高植物的抗逆性。

       ③ 植物根系分泌物作为植物对微生物的信号

       植物根系分泌物主要包括糖、氨基酸和有机酸，它们在细胞质中浓度很高。还有少量结构更为复杂的其他次级代谢产物如类黄酮、萜烯、酚类化合物，它们可以吸引特定的根际微生物。也有研究表明，植物根系分泌信号分子茉莉酸和水杨酸进入植物根际，在微生物初始定殖在植物根际的时间段参与根系和微生物之间的相互作用。根系分泌物受基因调控，不同基因的植物可以形成不同的根际细菌群落，从而导致不同植物之间、同种植物不同个体之间、以及同一植物个体在不同的发育阶段、不同的生长条件下和不同的生物相互作用下的分泌物高度不同。

       以上这些作用中的大部分都符合生物刺激剂作用的定义。

2  微生物类生物刺激剂及其功效

       欧盟肥料新法规第22款对植物生物刺激剂作如下定义：植物生物刺激剂是指那些不作为植物营养物质被输入到植物体内，而是刺激植物的自然营养过程的一些物质、混合物和微生物。这些物质的唯一目的是改进植物的营养利用效率、对非生物胁迫的耐受力、品质性状或增强土壤中或根际受限制的营养素的利用能力，植物生物刺激剂与肥料更相似，而与绝大多数类别的植物保护产品不同。植物生物刺激剂的作用是优化肥料的效率并降低其使用量，不同于肥料的作用。

       根据该法规，这类产品被排除在欧盟农药新法规Regulation（EU）No.1107/2009的管理范围之外。

       肥料新法规将植物生物刺激剂分为微生物类生物刺激剂和非微生物类生物刺激剂。

       微生物类生物刺激剂必须由肥料新法规附录II中第2部分允许的第7类组分材料（CMC7：微生物）即某种微生物或多种微生物群体所组成。植物生物刺激剂可以由微生物体或者空细胞微生物（empty cell micro-organisms）以及无害的培养基残余物组成。要求是：

       （1）只经历了干燥或冷冻干燥过程，而没有经过别的加工过程；

       （2）这些微生物属于如下类别：① 固氮菌属（Azotobacter spp.）；② 菌根真菌（Mycorrhizal fungi）；③ 根瘤菌属（Rhizobium spp.）；④ 固氮螺菌属（Azospirillum spp.）。

       值得注意的是，在欧盟的肥料新法规中没有“微生物肥料（microbial fertilizer）”这一概念。因此可以说在表1中列出的“直接促生作用和间接促生作用”中的大多数功效都符合微生物类生物刺激剂的定义。

       欧洲生物刺激剂工业理事会（EBIC）在其立场文件“欧盟如何鼓励微生物生物刺激剂的创新”中，列出了已经确定具有生物刺激剂作用的微生物菌株、种和属（表2）。这个清单里的微生物可以作为微生物类生物刺激剂的候选。

表2  已确定具有生物刺激剂作用的微生物菌株、种和属

       微生物的生物刺激剂作用已经得到广泛的实践证实。Martin Macouzet等总结了已经获得验证的微生物生物刺激剂对植物的特殊作用和可能的机制（表3）。

表3  已经确定的微生物类生物刺激剂对植物的特定作用和可能的机制

       英国农业和园艺发展委员会（AHDB）总结了在英国最常用的植物生物刺激剂的产品类别并分析了它们的功效。其中关于微生物类生物刺激剂产品的功效被列于表4中。

表4  英国最常用的微生物生物刺激剂类别及其生物功效

       注：A=证据基础差（主要是基于实验室的试验，对谷物或油菜的数据很少或没有）；B=适当的证据基础（大量的试验，包括一些基于谷物或油菜的田间试验）；C=有良好的证据基础（包括对谷物或油菜进行多次试验）；D=无证据基础（证据不足）。

       在当前气候变化迅速的情况下，作物种植更加频繁地遭受各种非生物和生物的危害，因此可导致全球农业生产损失增加30%～50%。植物与微生物共生体共同进化，在生态系统和植物层面上都扮演了重要角色。已有的研究发现，通过使用微生物类生物刺激剂，可在气候变化的压力下提高植物的性能和生产力。

       作为生物刺激剂的细菌可分为植物促生细菌（PGPB）和植物根际促生细菌（PGPR）两类，后者是一种特殊的根际定植菌。其中研究最多的属是伯克霍尔德菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷菌属和链霉菌属。

       Daniela Sangiorgio等综述了微生物生物刺激剂的抗逆能力研究。他们将影响植物生长的危害因素分为生物和非生物两大类，并阐述了微生物类生物刺激剂对各种危害因素的抵御机制，并且总结了分别能够抵御各种危害因素的微生物种类（表5～表6）。

表5  气候变化下植物面临的各种危害因素

表6  具有不同抗危害能力的微生物

3  支持生物刺激剂的产品声明的数据要求

       只有声明具有生物刺激剂作用的产品才可以作为生物刺激剂产品获得注册和使用。而生物刺激剂类产品的复杂性使得生物刺激剂功效声明变得不那么简单。生物刺激剂产品的复杂性表现在如下几个方面：

       ① 现有生物刺激剂产品具有多样性（包括微生物和非微生物产品）；② 有多种因素可影响产品的生物刺激剂效应；③ 生物刺激剂组分之间以及生物刺激剂与其他因子（如天气、土壤微生物、土壤类型、作物品种等）之间都可能产生复杂的相互作用。

       为了采用高质量的数据支撑生物刺激剂的声明，EBIC与主要利益相关者合作共同编制了数据要求指南，以支持生物刺激剂声明。

       支撑数据的数量取决于声明内容的多寡。产品声明内容越少，要求的支持数据也越少。公开发表的数据或现有的数据以及试验研究获得的数据都可以作为生物刺激剂产品声明的依据。在进行试验设计时，需要根据产品声明的内容，将各种影响因子，比如作物和作物组别、生长条件等考虑在内。此外，应该认识到对那些能够改善植物营养可获得性的生物刺激剂产品（通常是微生物类生物刺激剂），土壤类型和条件可能比作物种类本身更重要。因此试验设计需要灵活地适应这些情况。

       来自欧盟以外的在受控条件下（温室、生长室、表型等）获得的数据，如果测试的气候条件适用于欧盟而且满足以下要求，欧盟则应该接受这样的试验数据：① 如果试验数据产生于制造商自己的GEP/GLP认证设施；② 如果产生数据的独立研究合作伙伴（合同机构、大学等）被认为有信誉的，或如果制造商能够证明所采用的方法以及所获得数据的质量与GEP/GLP设施可以达到的质量基本相同。

4  微生物类生物刺激剂的生产

       微生物类生物刺激剂是规模较小但增长迅速的一类植物生物刺激剂。微生物类生物刺激剂产品可以包括如下几种：基于单个分离株的“纯菌株”发酵液；各种分离株的混合体或共发酵产物；或者源自有机物质处理的更复杂的“自然”微生物群落。

4.1  微生物生物刺激剂的菌株选择和特性

       高通量分析系统目前正被跨国公司所使用，他们正在竞相寻找、专利化和商业化PGPR领域的杰出代表。利用这种技术可以同时筛选大量的微生物，寻找一些反应产物。但是通过这种方式，也浪费了大量资源在来源不确定或与农业无关的微生物上。可见筛选出令人满意的微生物不是一件容易的事情。

       筛选微生物时，除了关注微生物的有效性，还要关注其安全性。必须避免已知的病原微生物或有毒微生物的存在。但是某些被认为“安全”的微生物种的某些特定菌株也还可能存在风险。例如，某些芽孢杆菌的菌株会引起皮肤过敏，还观察到枯草芽孢杆菌的某些菌株有出乎意料的溶血活性。

4.2  微生物生物刺激剂的生产

       即使获得了好的菌种，但是其生产不能适应产品的预期用途，好的菌种也变得毫无用途。因此，必须在生产过程中对微生物进行“训练”，使其适应产品用途。同样，许多具有生物刺激作用的生物活性代谢产物只有在可控制的发酵条件下才能优先产生，而不能在土壤中自然产生（因为植物根际促生细菌在土壤中还要与其他因素竞争）。

       与已知的益生菌及其活性类似，微生物生物刺激剂的有益效果不仅是因为它们直接作用于根际，还因为产品中存在生物活性物质（表7）。各种各样的生物活性化合物，有2种不同的来源：⑴ 通过特殊发酵条件诱导微生物代谢物的合成，并由微生物分泌到培养基中；⑵ 培养基中的成分在发酵过程中受到微生物的作用转化而成生物活性物质。因此，一个仅含有上述活性组分之一的生物刺激剂要比那些含有2个或更多活性组分的生物刺激剂表现更差。

表7  微生物类生物刺激剂的活性组分

       通过研究生产EVL Coating^®的专有发酵技术发现，它与通常推荐用于生产高含量微生物的培养基根本不同。它所用的培养基不是典型的能使细胞增长最大化的能量丰富的肉汤培养基。相反，培养基的组分清单显示，如下3个方面的成分格外引人注意：① 有不溶性矿物混合物，它们能使微生物细胞为矿物肥料的存在做好准备，这样有利于产生具有增强矿物溶解能力的微生物细胞；② 有富含蛋白质的组分，有报道称这种组分是通过微生物发酵生产的某种生物活性肽的来源；③ 含植物提取物，它能诱导微生物表达和分泌促植物生长的代谢物。由此可见，深入理解微生物类生物刺激剂背后的作用原理对于产品生产具有重要的指导意义。

       目前为止，各种微生物接种体在全球市场中占主要地位。一些公司出售含有单一菌种的PGPR培养物，它们具有精准的作用方式和作用目标，但是能够将具有广泛作用谱的功能性微生物菌群组装起来的产品却很少，表8为这类产品的一些代表。

表8  已经商业化的含有功能微生物菌群或由混合微生物发酵的产品

4.3  微生物类生物刺激剂的商品化现状

       有文献显示，目前基于微生物的生物刺激剂产品占整个生物刺激剂产品的25%以下。

       已经商业化的微生物类生物刺激剂的活性组分主要有如下2类：① 活的PGPR接种体；② 基于信号化合物的产品。

       Basharat Hamid等收集整理了目前全球范围内已经商品化的基于PGPR的生物刺激剂产品（表9）。

表9  商品化的基于PGPR的生物刺激剂产品

       中国农药管理部门目前没有参与生物刺激剂类产品的注册和监管，生物刺激剂都在农业农村部肥料主管部门作为肥料申请注册。国内尚无生物刺激剂的官方定义，也没有单独的监管规章。

       为了适应生物刺激剂的快速发展，中国生物刺激剂发展联盟（China Biostimulants Development Alliance，简称CBDA）于2016年应运而生，到2021年4月已有百余家会员单位。联盟于2018年8月23日发布了《生物刺激素 甲壳寡聚糖》团体标准。

       中国将微生物肥料分为3类：微生物菌剂、复合微生物肥、生物有机肥。每一类微生物肥料都有一种对应的国家标准或行业标准。按照欧盟对生物刺激剂的定义，中国的微生物菌剂中绝大多数都可作为微生物类生物刺激剂。

       “农用微生物菌剂”国家标准GB 20287—2006对农用微生物菌剂的定义为：目标微生物（有效菌）经过工业化生产扩繁后加工制成的活菌制剂。它具有直接或间接改良土壤，恢复地力，维持根际微生物区系平衡，降解有毒、有害物质等作用；应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，改善农产品品质及农业生态环境。显然，除了“降解有毒、有害物质等作用”这一功效之外，微生物菌剂的其他功效都符合微生物类生物刺激剂的定义。

       “复合微生物肥料”的行业标准NY/T 798—2015对复合微生物肥料做如下的定义：指特定微生物与营养物质复合而成，能提供、保持或改善植物营养，提高农产品产量或改善农产品品质的活体微生物制品。

       因此，根据EBIC对生物刺激剂的定义，复合微生物肥料因为含有营养物质而不属于生物刺激剂类。

       “生物有机肥”的行业标准NY 884—2012对生物有机肥的定义：指特定功能微生物与主要以动植物残体（如畜禽粪便、农作物秸秆等）为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。

       显然，生物有机肥因含有可提供营养的有机肥成分也不符合生物刺激剂的定义。

       根据原农业部的“有机物料腐熟剂”标准NY 609—2002定义，有机物料腐熟剂是能够加速各种有机物料（包括农作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾及城市污泥等）分解、腐熟的微生物活体制剂。从其用途看，显然不属于生物刺激剂。

       根据“农用微生物菌剂”国家标准GB 0287—2006的产品分类，农用微生物菌剂包括根瘤菌菌剂、固氮菌菌剂、解磷类微生物菌剂、硅酸盐微生物菌剂、光合细菌菌剂、有机物料腐熟剂、促生菌剂、菌根菌剂、生物修复菌剂等。据此，在农业农村部种植业管理司肥料登记查询端口，检索在该端口列出的微生物菌剂产品类别，所得各类产品的登记数量见表10。

表10  中国微生物菌剂产品登记记录

       表10中除生物材料腐熟剂、土壤修复菌剂、生物修复菌剂之外，微生物菌剂项下4,341条记录加上其他各项的记录共有4,441条记录都符合生物刺激剂定义。

       微生物类生物刺激剂能否成功获得商业化，还需要特别关注影响产品使用的各种风险因素，如生产、储存和使用方法等。此外，各种生物和非生物的环境因素也对产品的成功应用影响甚大，需要研究出相应的解决措施（表11）。

表11  影响微生物生物刺激剂成功应用的风险因素

5  微生物生物刺激剂产品的质量标准和标签要求

5.1  生物刺激剂的质量要求

5.1.1  欧盟肥料新法规对生物刺激剂的质量要求

       欧盟肥料新法规对所有类别的生物刺激剂的产品质量提出了一般性质量要求。肥料新法规规定植物生物刺激剂产品中污染物不能超过如下限量：① 镉（Cd）：1.5 mg/kg干物质；② 六价铬（Cr Ⅵ）：2 mg/kg干物质；③ 铅（Pb）：120 mg/kg干物质；④ 汞（Hg）：1 mg/kg干物质；⑤ 镍（Ni）：50 mg/kg干物质；⑥ 无机砷（As）：40 mg/kg干物质。植物生物刺激剂中铜（Cu）含量不能超过600 mg/kg干物质，锌（Zn）含量不能超过1,500 mg/kg干物质（因为铜和锌可作为营养素，含量不能太高，否则就是在提供营养素，不再是生物刺激剂产品）。

       植物生物刺激剂对其标签上指定的植物必须具有标签声明的作用。

       肥料新法规对微生物类植物生物刺激剂的质量要求：① 微生物类生物刺激素应包括附录Ⅱ第2部分CMC 7中所述的微生物或微生物联合体。② 微生物类生物刺激剂[PFC 6(A)]中病原微生物的量不能超过表12列出的限度。③ 液体微生物类生物刺激剂产品，其pH应对所含微生物以及目标作物最优。

表12  微生物类生物刺激剂中病原微生物的限量

5.1.2  中国农用微生物菌剂的国家标准GB 20287—2006规定了产品技术指标和污染物限量（表13和表14）

表13  农用微生物菌剂的技术指标

       注：^a复合菌剂，每一种有效菌的数量不得少于0.01亿/g或0.01亿/mL。由单一的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilagnosus）制成的粉剂产品中有效活菌数不少于1.2亿/g。^b此项仅在监管部门或仲裁部门认为必要时检测。

表14  农用微生物菌剂的无害化技术指标

5.1.3  印度肥料法（1985）中对植物生物刺激剂的质量要求

       印度2020年拟修订其1985年肥料法，将生物刺激剂加入到肥料管理法中。在修改草案中规定了生物刺激剂产品的类别以及产品中重金属的允许含量。

       生物刺激剂类别包括：① 植物提取物，包括海藻提取物；② 生物化学物质；③ 蛋白质水解物和氨基酸；④ 维生素；⑤ 无细胞微生物产品；⑥ 抗氧化剂；⑦ 抗蒸腾剂；⑧ 腐殖酸和黄腐酸及其衍生物。

       产品中存在的重金属不应超过以下最大限度：① 镉（以Cd计）5.00 mg/kg；② 铬（以Cr计，Ⅵ价铬）50.00 mg/kg；③ 铜（以Cu计）300.00 mg/kg；④ 锌（以Zn计）1,000.00 mg/kg；⑤ 铅（以Pb计）100.00 mg/kg；⑥ 砷（以As₂O₃计）10.0 mg/kg。

       此外，还规定任何生物刺激剂产品中不得含有超过0.01 mg/L浓度的农药有效成分。

5.2  植物生物刺激剂的标签要求

5.2.1  欧盟肥料新法规对植物生物刺激剂的标签要求

       （1）植物生物刺激剂（PFC 6，PFC即产品功能类别）标签需要提供的信息

       ① 物理状态；② 生产日期和有效期；③ 使用方法；④ 对目标植物的作用；⑤ 与产品效果有关的任何指导，包括土壤管理规范、化学肥料使用、与植物保护产品（农药）的不相容性，推荐的喷嘴大小、喷雾压力和其他防飘移措施。

       （2）对微生物类生物刺激剂[PFC 6(A)]的标签有特别要求

       任何有意加入的微生物都必须标明。有几种不同菌株的微生物，必须标明实际加入的菌株。微生物浓度须采用单位重量或单位体积的活性单位数（number of active units）表述，或者用其他与微生物有关的表述方法，如每克菌落数量（CFU/g）。标签必须包含如下警示语：“微生物可能导致过敏反应。”

       （3）对含有植物生物刺激剂的肥料混合物（PFC 7）的标签要求

       所有适用于欧盟的所有成分的肥料产品的标签要求，均适用于该肥料产品混合物，并须与最终的肥料产品混合物一并表达。

       当肥料产品混合物中含有一种或多种植物生物刺激剂时，混合物中每种植物生物刺激剂的浓度应以g/kg（20℃）或g/L（20℃）表示。

       （4）产品含量允许差规则

       微生物类生物刺激剂PFC 6(A)的允许差：微生物的实际浓度与申报值的偏差不得超过15%。

       需要指出的是，EBIC认为在微生物类生物刺激剂产品中微生物的数量不能代表产品的效力，应该使用生物效价表示产品微生物。

5.2.2  南非对植物生物刺激剂的标签要求

       南非把生物刺激剂类产品作为第3组肥料，并于2019年颁布了登记要求和标签要求。如果一种产品既作为生物刺激剂又作为生物农药，则必须分别获得肥料登记证和农药登记证。

       对微生物类生物刺激剂，产品中包含的所有微生物和代谢物必须：① 用科学的程序进行鉴定；② 菌种必须保藏在农业研究理事会（ARC）或在南非的其他注明的收藏单位；③ 包含入境数据或“微生物凭证”；④ 须附有经批准的风险评估，表明它是尚未释放到南非环境中的微生物，但是它对人类、植物动物或环境没有潜在的危害。

       如果微生物类生物刺激剂产品拟进口到南非，则必须提交如下各种许可证书：① 试验用进口许可证；② 允许申请人在南非商品化该产品的信函；③ 大量释放许可证；④ 采购收据，详细说明微生物的名称、来源国、属和种的识别（使用最新命名法）。

       作为生物刺激剂产品，其标签必须包括如下内容：产品名称、肥料类别（第3类）、有效成分名称（微生物有效成分必须给出每种微生物的属和种的名称）、有效成分浓度（微生物有效成分必须给出微生物的活菌单位数，即CFU/mL）、批号和生产日期（微生物成分必须与分析证上的CFU数对应）、净重、注意事项、使用指导、使用方法和警告等。

6  结语

       利用植物有益微生物为未来的作物生产和作物保护保驾护航是目前跨国农化公司和各国政府农业和农化产品主管部门一致认同的方向。虽然，目前世界各国关于微生物农药、微生物肥料以及微生物类生物刺激剂等界定还没有达成统一，但是这些都是利用对植物有益的微生物保护作物生产。因此，关注微生物在作物生产上的利用，尤其是微生物类生物刺激剂的开发非常重要。中国是微生物肥料开发和生产的大国，目前登记的微生物肥料品种丰富，相信其中某些产品可能成为优秀的微生物类生物刺激剂，值得深入开发其更大的使用价值。